顶刊综述 | 光学单分子检测进展：迈向超灵敏生物亲和性测定
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《ANGEW CHEM INT EDIT》杂志发表综述，阐述了光学单分子检测的理论背景，介绍了多种光学单分子标记技术，并选取多种用于检测蛋白或核酸的生物亲和性测定作为示例。本文对这篇综述作一简单的译文和解读。
1.前言
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本综述集中于光学单分子生物亲和性测定，不包括电化学和基于力的技术等其他新兴单分子检测。
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生物亲和技术可通过抗体、适配体、分子印迹聚合物来特异性结合和捕获分析物。
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结合事件的检测可通过两种方法进行：①在无标记分析中，分析物与检测元件的结合导致可以直接测量的信号变化；②在Sandwich夹心法中，携带信号产生标记的第二亲和试剂与分析物结合。 -
生物亲和性测定可以根据检测标记进行细分(图1)。相较于无标记检测，有标记检测可以强烈放大信号，更适用于单分子分析。酶标记由于更安全、可将信号放大数千倍、相对容易进行等原因，在临床诊断和环境应用中被认为是定量测量的金标准。 -
在以往，免疫分析的发展主要通过提高检测的灵敏度、特异度和可重复性。开发更敏感的免疫测定对于测量痕量标志物、发现新的潜在生物标志物至关重要。 -
免疫分析的第二条发展路线在于使用更少的样品量实现更快的通量，以及可以在样品收集现场直接进行的测定(床旁测试或环境、食品采样)。 -
单分子检测的优势并不在于更高的灵敏度，而是降低背景噪声的强大工具，使测量更加稳定，从而间接降低检测限。 -
将检测体积减少到飞升(1 fL = 10^-15 L)体积可显著降低背景信号，但需要解决两个问题：极低浓度的分析物通过扩散达到检测体积的时间较长；分析物分子在观察体积内的随机波动造成泊松噪声。
ELISA已经成功地转化为单分子免疫分析。然而，酶促底物周转是一个动力学过程，需要时间，这导致产物扩散，因此在分析物的空间定位上无法检测到信号。目前有两种方法可将信号定位到分析物上：
酶促反应在分析物周围产生一种沉淀产物，使分析物结合位点产生局部高荧光信号。
酶标记将底物转化为可溶性荧光产物，为了防止产物扩散，反应必须被限制在非常小的空间内，如病毒衣壳、脂质囊泡、微流体液滴、飞升阵列等。
Walt团队首创了基于飞秒激光阵列中荧光酶促反应的单分子免疫分析。Quanterix公司已将其商业化，建立了Simoa单分子阵列平台(图2)：带有捕获抗体的磁珠与分析物结合，通过链霉亲和素-生物素放大系统产生荧光信号，被装载到飞升阵列上。通过计算荧光孔的数量，以数字方式确定分析物浓度。
基于产生油包水微滴的不同方法，乳化方法产生的微液滴往往不均匀，而微流体装置可以产生和处理更均匀的微液滴，可用于建立磁珠酶联免疫分析(图3)。LOD可达到46 fM，线性范围可达到0.046-4.62 pM。
微芯片上的微流体能够在皮升或飞升反应容器中快速分离单链DNA，随后进行PCR扩增，LOD可达到每毫升40个RNA分子。
基于液滴的数字免疫PCR (ddIPCR)使用磁珠作为固体支持物，DNA作为标记物，PCR用于信号放大，较标准ELISA可将LOD降低100-10000倍(图4)，但清洗步骤不易实现。
数字PCR与邻位连接技术(PLA)相结合可进一步提高分析的精确度。
单个荧光分子的检测依赖于共焦显微镜和全内反射显微镜(TIRF)。根据不同的检测形式可分为：
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单分子下拉检测(图5) -
用于检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和肿瘤抑制蛋白p53的单分子检测(图6)
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使用分裂适配体的数字ATP检测
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用于检测小分子的适配体传感器(图7)
4.2 毛细管内的激光诱导荧光检测 与分析物结合的带有荧光标记的抗体具有较低的电泳迁移率，在毛细管电泳中可与游离抗体区分开，通过宽视野显微镜记录。例如Erenna平台检测心肌肌钙蛋白（LOD达0.2-1.7 pg/ml）、可溶性Ab低聚物（LOD达1.56 pg/ml）、突变型亨廷顿蛋白mHTT（LOD达40 fm）、人促性腺激素卵泡刺激素（LOD达34 fm）。
4.3 荧光相关光谱学
- 荧光相关光谱(FCS)记录单分子水平的扩散，可以用来跟踪分子与其他分子的相互作用。通过FCS在单分子水平检测荧光标记分子，可免于清洗、分离步骤，降低表面非特异性结合，适用于均相免疫测定，但容易受到背景干扰。FCS免疫测定最简单的方案是基于免疫复合物形成后扩散速率的变化(图8)。
- 荧光交叉相关光谱(FCCS)使用两种光谱不同的荧光探针，通过不同的激发波长同时激发，并在两个不同的通道中检测，计算互相关曲线的振幅，以测量荧光探针与分析物的相互作用(图9)。可提高定量测定的灵敏度。
5.纳米颗粒标记 近年来，具有发光或等离子体性质的纳米颗粒被作为免疫分析的标记。与分子标记相比显示出更高的信号、更易进行光学读出，但缺点是尺寸较大，可能导致更大的空间位阻以及更高程度的非特异性结合。
5.1 半导体纳米颗粒 量子点(QDs)是尺寸通常在1和10 nm之间的荧光半导体纳米晶体。量子点的发光特性可以通过改变纳米晶体的尺寸来调节，从而能在380至2000 nm的范围内调节发射波长。与传统荧光团相比具有更高的发射强度、更好的光稳定性、更宽的激发光谱和更窄的发射带宽。
5.1.1 表面结合分析物的检测 Liu等人开发了基于QD标记的夹心免疫测定法，使CEA和AFP的LOD分别达到了6.7 fm和3.4 fm。
5.1.2 微通道中的检测 - 用于病毒检测的夹心免疫测定。
- 用于检测可卡因的基于适配体的单QD FRET分析。
- 超窄通道芯片集成系统的高通量分析法(图10)。
5.1.3 荧光相关光谱学 - 使用较大的纳米颗粒替代小的荧光标记分子，游离免疫试剂和免疫复合物之间的扩散时间差异增加，可提高FCS的灵敏度。据报道，利用基于QD的探针的夹心适体FCS分析检测血清凝血酶，LOD为2.6 nm，工作范围为5-500 nm。
- 使用QDs可更方便地实现单波长激发FCCS (SW-FCCS)，用于检测甲胎蛋白(AFP)的LOD可达到20 pm(夹心测定)和180 pm(竞争性测定)。
5.2 光子上转换纳米颗粒 光子上转换纳米颗粒(UCNPs)可在近红外(NIR)激发下发射较短波长光(反斯托克斯发射)，大大减少了自发荧光和光散射。UCNPs的其他优点包括光稳定性高和多个窄的发射带，可用于多种分析物的并行多重检测。
5.2.1 表面固定的分析物的检测
已开发一种通过传统的表面发光显微术可视化单个UCNP的方法，应用于PSA的灵敏检测(图11)，LOD达到1.2 pg/ml，并覆盖了三个数量级的动态范围。基于聚乙二醇包被的UCNPs与链霉亲和素复合物的检测标记进一步将LOD降低至20 fg/mL。
5.2.2 荧光相关光谱学 如果样品可自发强荧光，由于光谱重叠，亚纳摩尔浓度的标记的FCS/FCCS信号将不可检测。但可以通过使用更亮的标记或者通过测量UCNP标记的互相关，以避免光学背景干扰。
5.3 等离子体纳米颗粒等离子体纳米颗粒能够基于其光散射特性和分析物结合时的光谱变化进行高灵敏度的检测。最常见的材料包括金(Au NPs)和银(Ag NPs)。银纳米颗粒更容易被氧化因而不太稳定，但具有更高的消光系数和更强的拉曼和荧光增强。
5.3.1 暗场显微术 - 一种基于抗体的单粒子散射强度分析，用于检测各种临床癌症标志物，如AFP、CEA和PSA，LOD达到1至6 pm。
- 一种基于磁珠的夹心免疫测定法(图12)。
- 智能手机商用相机用于高通量读取等离子体共振(LSPR)光谱(图13)。
- 一种基于平衡态统计涨落提取亲和常数的方法。
- 一种基于数字适配体的检测凝血酶的方法。
5.3.2 光散射相关光谱学 共振光散射相关光谱(RLSCS)测量由于单个纳米颗粒的布朗运动而引起的小体积共振光散射的波动(图14)。已有研究用于甲胎蛋白的夹心免疫测定(LOD 1 pm)[117]以及甲胎蛋白(LOD 100 pm)和17-b-雌二醇(LOD 10 pm)的竞争性测定。RLSCS的主要限制之一是纳米颗粒标记聚集的显著效应。
5.3.3 表面等离子体显微镜 表面等离子体显微镜可以实时跟踪单个等离子体纳米颗粒的吸附。开发了一种检测和量化单个纳米颗粒的宽场方法，并将其用于分析复杂样品（如葡萄酒、苹果汁和防晒霜）中的金和银纳米颗粒(图15)，该方法的LOD为106 NPs/mL，工作范围为10^6–10^10 NPs/mL。
5.3.4 微阵列检测 使用金纳米棒作为标记在蛋白质微阵列上检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，LOD可达到3.2 pg/ml。
6.微球标记 6.1 荧光显微法 - 采用掺铕磁珠通过时间分辨荧光(TRF)检测PSA，LOD达0.38 pg/ml；
- 使用彩色编码磁珠同时检测三种不同类型禽流感的单个病毒颗粒(图16)，LOD达0.02 pg/mL；
- UCNPs嵌合微珠用于DNA多重检测。
- 基于单个荧光珠子的夹心检测法(图17)
6.2 明视野显微术 - 开发了一种基于微流体的磁珠计数法，用于检测血清中的蛋白质(图18)。将磁性预浓缩步骤与微流控芯片中结合的磁珠的数字计数相结合，用于检测TNF-α，LOD达到1 fg/ml。
6.3 暗场显微术 束缚粒子监测可以用于在免疫测定中监测单分子结合事件。
- 利用束缚粒子监测通过暗场显微镜开发了基于适体的夹心法进行凝血酶检测(图19)。
- 开发了一种基于拴系颗粒监测的检测PSA的夹心免疫测定法，达到了1 pm PSA的LOD。
- “数字化均相非酶免疫吸附测定法”(HoNon-ELISA)将束缚粒子监测与飞升阵列中的免疫测定结合起来，达到了0.093 pg/mL PSA的LOD。
7.无标记检测 大多数无标记检测方案基于等离子体效应。
- 等离子体纳米结构的排列对分析物结合非常敏感。局部表面等离子体共振(LSPR)可用于追踪等离子体纳米颗粒附近局部折射率的变化，从而与分析物的存在联系起来。例如，使用金纳米棒检测生物素和抗生物素抗体的相互作用(图20)。
- 回音壁模式(WGM)微环谐振器可用于检测无标记分子(图21)，分析物与光环谐振器的结合导致谐振波长的移动。
- 表面增强(SERS)和尖端增强拉曼光谱(TERS)也能够实现单个蛋白质分子的无标记检测，但难以在常规检测中应用。
8.总结和展望 一些单分子免疫测定平台已经商业化，涉及的生物标志物包括细胞因子、激素和信号蛋白，此外还提供定制开发服务和试剂盒。
- 默克：Erenna系统，49个即用型免疫分析试剂盒
- Quanterix：Simoa平台，130个试剂盒
商业化的挑战：
- 单分子检测的高灵敏度仍难以实现
- 检测程序的操作难度和稳定性
尽管存在一些挑战，单分子分析正在进入实际应用，用于检测新的和低丰度疾病标志物，并可能取代ELISA或电化学发光分析等常规方法。
原文信息： Advances in Optical Single-Molecule Detection: En Route to Supersensitive Bioaffinity Assays Dr. Zdeněk Farka,Matthias J. Mickert,Matěj Pastucha,Zuzana Mikušová,Prof. Dr. Petr Skládal,Priv.-Doz. Dr. Hans H. Gorris Angewandte Chemie International Edition 59.27 (2020): 10746-10773. DOI: 10.1002/anie.201913924 Publication Date: 23 December 2019 Copyright © 2019 The Authors. Published by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201913924 光与生物
深圳市光与生物科技有限公司致力于将新方法、新仪器和医学大数据相结合，构建新一代蛋白质组的大数据平台，成为利用蛋白质组解决重疾早筛的领跑者。主要应用于癌症筛查及伴随诊疗、心脑血管疾病、神经系统疾病、子痫前期监测、器官损伤检测、眼科、儿科疾病检测等科研领域及临床医学领域。 公司创始人何皓博士于2019年10月归国创立光与生物，将先进技术进行产业转化。 公司使命：早检测 早发现 天下无重症 公司愿景：成为利用蛋白质组解决重疾早筛的领跑者 
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